Q：WGBS 的材料與方法

A：【查看】

Q：在植物種應(yīng)用 WGBS 技術(shù)的典型文獻(xiàn)

A：高粱 【查看】

擬南芥 【查看】

Q：全基因組甲基化測(cè)序（WGBS）的低限 DNA 起始量需要多少？

A：1ug，純化后 3ug。

Q：FFPE 樣本可以做 WGBS 嗎？

A：不建議，如果起始量足夠可以嘗試。

Q：WGBS 的特點(diǎn)是什么？

A：全基因組覆蓋，得到更多 CpG 位點(diǎn)信息，還能獲得 CHG、CHH 位點(diǎn)的甲基化信息。

Q：WGBS 適用于什么物種？

A：只有有參考基因組的物種都可以做 WGBS，非常適合于基因組較小的植物。

Q：WGBS 建議測(cè)序數(shù)據(jù)量是多少？

A：通常建議測(cè)基因組大小 *30 的數(shù)據(jù)量，比如人的參考基因大小為 3G, 建議測(cè)序 90G.

Q：甲基化與表達(dá)的關(guān)聯(lián)分析可以做嗎？

A：可以，伯豪積累了許多相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，還可以將甲基化與 mRNA、lncRNA 分別進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。可參考附件。【查看】

Q：de novo 測(cè)序的主要技術(shù)參數(shù)有哪些？
A：樣本類型：total RNA
      樣本總量：>=2 μg
      樣本濃度：>=50 ng/ul
      推薦數(shù)據(jù)量：>=6 Gb/ 樣本

Q：目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序有物種限制嗎？

A：基于超高重 PCR 的擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域后重測(cè)序，可以針對(duì)連續(xù)區(qū)段、外顯子靶標(biāo)以及客戶指定區(qū)域，特異性設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，經(jīng)過(guò)引物優(yōu)化及修飾，多重 PCR 一次性捕獲所有位點(diǎn)。只要有參考序列即可，沒有物種限制。

Q：目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序技術(shù)參數(shù)？

A：

Q：目標(biāo)區(qū)域重測(cè)序的樣本要求？

A：基因組 DNA，要求：DNA 濃度≥40ng/ul，體積 >20ul。純度 OD260/OD280 在 1.8～2.0 之間。

Q：CytoScan CNV 芯片的低限 DNA 起始量需要多少？

A：500ng。DNA 濃度不低于 55ng/μl，OD 260/280 值應(yīng)在 1.7～2.0 之間，A260/A230 > 1.5；RNA 應(yīng)該去除干凈；不含有其它個(gè)體或其它物種的 DNA 污染。

Q：OncoScan CNV 芯片的低限 DNA 起始量需要多少？

A：DNA Qubit 定量滿足大于 80ng，彌散帶在 500bp 左右，并且無(wú)明顯污染即可。如提供 FFPE，需提供切片厚度為 10μm 左右的 FFPE 切片 10 片左右。如保存年限太久、保存不當(dāng)、組織過(guò)少時(shí)，DNA 電泳可能無(wú)法看到明顯條帶。

Q：mRNA 測(cè)序推薦測(cè)序量多少？

A：推薦測(cè)序數(shù)據(jù)量至少為 6G。

Q：請(qǐng)?zhí)峁┪锓N拉丁名，真菌和細(xì)菌還需要 菌株號(hào)。

A：例如：Mycobacterium tuberculosis H37Rv。

Q：FPKM 的大小如何衡量？

A：一般認(rèn)為 FPKM>1 是基因表達(dá)的，這個(gè)閾值是主流雜志推薦的；如果做 qPCR 驗(yàn)證，建議 FPKM>10。

Q：樣品間的相關(guān)性如何評(píng)價(jià)？

A：用相關(guān)系數(shù)和 PCA，組內(nèi)樣本間的相關(guān)性應(yīng)明顯大于組間的相關(guān)性，才是比較成功的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，差異基因會(huì)比較多。

Q：沒有生物學(xué)重復(fù) 被審稿人 argue 怎么辦？

A：（1）正面回答審稿人問(wèn)題，不要企圖回避；

（2）建議你把與結(jié)論重要的相關(guān)基因進(jìn)行 qPCR 驗(yàn)證一遍，用數(shù)據(jù)說(shuō)話：“雖然沒有重復(fù)，但 qPCR 的結(jié)果支持測(cè)序結(jié)果； 

（3）去數(shù)據(jù)庫(kù)查找類似的研究數(shù)據(jù)來(lái)支持結(jié)論。

Q：全基因組重測(cè)序都包括哪些分析內(nèi)容？

A：標(biāo)準(zhǔn)分析內(nèi)容包括 SNV、InDel、CNV、SV。

Q：全基因組重測(cè)序的測(cè)序深度多少合適？

A：全基因組重測(cè)序是對(duì)已有參考基因組序列的物種的個(gè)體或群體進(jìn)行重新測(cè)序，通過(guò)與原有基因組進(jìn)行比較，得出豐富的全基因組變異信息。隨著測(cè)序成本的降低和分析技術(shù)的成熟，目前全基因組重測(cè)序在不同物種、不同應(yīng)用和研究領(lǐng)域均已有廣泛應(yīng)用。根據(jù)客戶的研究需求可以達(dá)到對(duì)應(yīng)的測(cè)序深度，一般來(lái)說(shuō)≥30X 可以滿足 SNV、InDel、CNV、SV 的數(shù)據(jù)需求；當(dāng)然測(cè)序深度越高，變異檢出的可信度越高。

Q：全基因組重測(cè)序的 DNA 樣本要求？

A：總量≥ 2 μg，濃度≥ 50 ng/μl，有明顯主帶，無(wú)污染。

Q：全基因組重測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程是？

A：【查看】

Q：人重測(cè)序的材料與方法中英文參考？

A：【查看】

Q：人重測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組比例能到到多少？

A：樣本比對(duì)到參考基因組的比例一般情況下達(dá)到 99% 以上，如果過(guò)低說(shuō)明樣本可能存在污染。

Q：表達(dá)譜芯片的樣本起始量是多少？

A：

Q：芯片實(shí)驗(yàn)的項(xiàng)目周期是多長(zhǎng)？

A：我們有豐富的芯片實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，完善的數(shù)據(jù)分析流程，確保在樣品質(zhì)檢合格后，20 個(gè)工作日內(nèi)出具詳細(xì)的結(jié)果報(bào)告。

Q：FFPE 樣本是否可以用芯片進(jìn)行 RNA 檢測(cè)嗎？

A：可以的，Affymetrix 的幾款芯片像 U133 Plus 2.0，Primeview，Clariom D 都可以用于 FFPE 樣本的檢測(cè)。

Q：如果要做表達(dá)譜芯片，送樣要求有哪些？

  不同樣本有不同的送樣要求，伯豪芯片實(shí)驗(yàn)室總結(jié)的送樣要求可供參考：

Q：伯豪客戶利用表達(dá)譜芯片發(fā)表了哪些文章？

A：伯豪擁有 Agilent 和 Affymetrix 主流的表達(dá)譜芯片，助力客戶發(fā)表了大量的文章，附件詳細(xì)地列出了利用各款表達(dá)譜芯片發(fā)表的文章 【查看】

Q：芯片結(jié)果都需要 RT-qPCR 定量驗(yàn)證么？定量驗(yàn)證需要注意哪些事項(xiàng)？

A：芯片檢測(cè)是一種高通量的篩選工具，后期需要進(jìn)行一系列的驗(yàn)證工作，其中 RT-qPCR 是常見也是簡(jiǎn)便的芯片結(jié)果驗(yàn)證方法。通常在拿到芯片結(jié)果后，可以按照鏈接中的方法用 RT-qPCR 對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證 【查看】。

Q：如何判斷芯片結(jié)果的好壞？

A：主要從兩個(gè)方面來(lái)考慮：

（1）圖象：

        主要看芯片掃描圖有無(wú)劃痕，有無(wú)圖象缺失，圖象是否清晰，背景是否過(guò)高，點(diǎn)是否規(guī)則，大小是否均一，有無(wú)融點(diǎn)，拖尾等   現(xiàn)象，圖象均一性如何，是否存在邊緣不清晰，陽(yáng)性及陰性內(nèi)參的情況等。

（2）數(shù)據(jù)：

        ①檢出率是否異常；

        ②相關(guān)系數(shù)（重復(fù)性如何）；

        ③變異系數(shù)（CV 值大小）；

        ④與 qPCR 趨勢(shì)的吻合程度；

        ⑤技術(shù)重復(fù)中差異基因的重復(fù)程度等。

Q：芯片結(jié)果里面 CV 值多大合適？

A：CV 值是標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值之比，用百分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算公式為：CV = SD/Mean×100%。通過(guò)比較兩組數(shù)據(jù)之間的 CV 值來(lái)判斷芯片體系是否穩(wěn)定。在 Agilent 表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)中，用重復(fù)探針點(diǎn)（10 次重復(fù)）信號(hào)的 CV 值來(lái)計(jì)算芯片的穩(wěn)定性和技術(shù)的穩(wěn)定性，不同的芯片這樣的探針點(diǎn)從 20 到 100 個(gè)不等。Agilent 商品化芯片的 CV 值合格閾值是低于 15%。

Q：芯片檢出率大小有沒有什么標(biāo)準(zhǔn)，多大合適？

A：芯片檢出率沒有也不應(yīng)該有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樾酒皇且粋€(gè)檢測(cè)工具，芯片實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是以數(shù)據(jù)的形式反映出樣本里基因表達(dá)的情況，也就是說(shuō)檢出率是樣品本身的屬性，而不是評(píng)價(jià)芯片實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的指標(biāo)。即使對(duì)于同一個(gè)物種，不同材料檢出率也不同，比如，人組織的檢出率要明顯高于細(xì)胞。一般來(lái)說(shuō)相同樣品的檢出率相差不超過(guò)±5%。

Q：lncRNA 芯片的樣本起始量是多少？

A：

Q：lncRNA 芯片適用于哪些物種？

A：目前我們有三款 SBClncRNA 芯片，分別可以用于檢測(cè)人、小鼠和大鼠的 lncRNA 表達(dá)情況。 

Q：SBClncRNA 芯片有哪些優(yōu)勢(shì)？

A：SBC lncRNA 芯片主要有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：

（1）采用 Agilent eArray 平臺(tái)設(shè)計(jì)，Agilent SurePrint 技術(shù)合成，檢出率高，技術(shù)重復(fù)性高于 99%；

（2）覆蓋主流 lncRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)的 lncRNA 信息，可同時(shí)檢測(cè) lncRNA 和 mRNA，便于挖掘兩者之間的關(guān)聯(lián)性；

（3）芯片實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用隨機(jī)引物擴(kuò)增的方式，可同時(shí)擴(kuò)增帶 poly- A 和不帶 poly- A 的 lncRNA。

Q：有客戶用 lncRNA 芯片結(jié)果發(fā)表文章的么？

A：有的，lncRNA 近來(lái)來(lái)是非編碼 RNA 研究的熱點(diǎn)，伯豪助力多位老師利用 lncRNA 芯片發(fā)表影響因子不低的文章，詳見附件 【查看】。

Q：lncRNA 芯片結(jié)果在進(jìn)行定量驗(yàn)證時(shí)，有哪些注意事項(xiàng)？

A：lncRNA 的定量驗(yàn)證方法與 mRNA 基本相同，需要特別注意的是對(duì)于“exonic_sense”來(lái)源的 lncRNA，在引物設(shè)計(jì)時(shí)一定要區(qū)分開 lncRNA 和 mRNA。驗(yàn)證過(guò)程中需要注意的事項(xiàng)請(qǐng)?jiān)斠姼郊?【查看】 。

Q：如何獲得 lncRNA 的序列信息？

A：我們的 SBC lncRNA 芯片是基于主流 lncRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)的，在芯片結(jié)果中我們會(huì)列出每個(gè)探針對(duì)應(yīng)的 lncRNA 詳細(xì)的信息可以直接根據(jù) accession 號(hào)在相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 lncRNA 序列信息的查找。由于目前 lncRNA 的研究還處在初級(jí)階段，很多 lncRNA 都是預(yù)測(cè)的，因此隨著研究的深入，會(huì)發(fā)現(xiàn)部分 lncRNA 并非真的為 lncRNA。如果芯片結(jié)果里出現(xiàn)某些 lncRNA 在相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中查找不到序列信息，那么很有可能該 lncRNA 已經(jīng)不被該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了。

Q：lncRNA 有哪些研究方向？

A：lncRNA 研究目前可分為 biomarker 研究和分子機(jī)制研究這兩個(gè)方向。  由于 lncRNA 具有組織特異性，且已有相關(guān)研究報(bào)道 lncRNA 在疾病組織和血液中特異性表達(dá)，因此，lncRNA 是一類理想的疾病研究潛在 Biomarker。

lncRNA 可以與蛋白復(fù)合體結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄；可以影響 mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯；可以作為 miRNA 的”sponge”；可以作為 miRNA 的前體分子等。從 lncRNA 的分子作用機(jī)制入手，是目前 lncRNA 研究的熱點(diǎn)。

Q：如何去研究一個(gè) lncRNA 的生物學(xué)功能？

A：目前已知功能的 lncRNA 很少，根據(jù) lncRNA 可以調(diào)控 mRNA 的特點(diǎn)，進(jìn)行 lncRNA 靶基因預(yù)測(cè)，通過(guò)靶基因的功能間接推測(cè) lncRNA 的功能。

      lncRNA 的靶基因預(yù)測(cè)分為 cis 預(yù)測(cè)與 trans 預(yù)測(cè)。Cis 預(yù)測(cè)的原理是找出 lncRNA 所處染色體位置上下游 10 kb 范圍內(nèi)的蛋白編碼基因。Trans 預(yù)測(cè)先采用 blast 選出序列上與 lncRNA 互補(bǔ)的 mRNA 序列，再利用 RNAplex 計(jì)算兩序列之間的互補(bǔ)能量，篩選出可能穩(wěn)定結(jié)合的 mRNA。

Q：lncRNA 有哪些不同分類？

A：根據(jù) lncRNA 與編碼蛋白基因的關(guān)系，可以把 lncRNA 分為 5 類：

（1）Sense- overlapping：與 mRNA 外顯子有重疊區(qū)，轉(zhuǎn)錄方向一致；

（2）Antisense-overlapping：與 mRNA 外顯子有重疊區(qū)，轉(zhuǎn)錄方向相反；

（3）Bidirectional：與 mRNA 轉(zhuǎn)錄方向相反，轉(zhuǎn)錄起始位置距離在 1kb 內(nèi)；

（4）Intronic：lncRNA 完全落編碼蛋白基因的內(nèi)含子中；

（5）lncRNA 位于編碼蛋白基因的基因間區(qū)。