Q: 什么是 Visium 空間轉(zhuǎn)錄組？
Visium 空間轉(zhuǎn)錄組是在組織原位檢測全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的一種技術(shù)，使得我們在檢測基因表達(dá)水平的同時(shí)，獲得基因在組織內(nèi)部空間表達(dá)的位置信息。與空間轉(zhuǎn)錄組相比，傳統(tǒng)的全基因轉(zhuǎn)錄組或單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，丟掉了基因或細(xì)胞在組織內(nèi)的空間分布信息，而廣泛應(yīng)用的 RNA 探針雜交，這只能同時(shí)檢測有限的幾個(gè)基因在組織內(nèi)的空間表達(dá)分布。而空間轉(zhuǎn)錄組可以將基因表達(dá)與 H &E 染色的結(jié)果疊加在一起，不需要對組織進(jìn)行消化，從而保留了組織內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，這樣使得我們可以研究組織內(nèi)部不同區(qū)域的細(xì)胞異質(zhì)性。
Visium 基因表達(dá)玻片上有 4 個(gè)捕獲區(qū)域，也就是圖片上展示的 4 個(gè)小方框，每個(gè)捕獲區(qū)域的大小是 6.5mm 乘 6.5mm，每個(gè)捕獲區(qū)域大約有 5000 個(gè) spot，也就是圖上所示的小圓點(diǎn)，每個(gè) spot 的直徑是 55μm，兩個(gè) spot 的中心點(diǎn)的距離是 100μm，每個(gè) spot 上面有數(shù)百萬條 oligo。每個(gè) spot 上所有 oligo 的 Spatial Barcode 的序列都是相同的，而不同的 spot 之間 Spatial Barcode 是不同的，這樣通過 Spatial Barcode，就能夠知道每條 mRNA 到底位于哪個(gè) spot，也就獲得了 mRNA 的空間位置信息。UMI 用于基因表達(dá)定量，可以知道每個(gè) spot 上有哪些基因表達(dá)以及他們的表達(dá)量。poly- A 用于捕獲 mRNA。4 個(gè)捕獲區(qū)域內(nèi)的 Spatial Barcode 是相同的，但每個(gè)捕獲區(qū)域內(nèi)不同的 spot 之間 Spatial Barcode 是不同的。
總實(shí)驗(yàn)流程分為三個(gè)部分：?? ? ? ?
一是樣本制備及預(yù)實(shí)驗(yàn)，二是組織優(yōu)化，三是基因表達(dá)。
首先獲取組織樣本，進(jìn)行冷凍，OCT 包埋，將包埋好的組織進(jìn)行冰凍切片，將切好的組織放置于常規(guī)玻片上。接下來對組織切片進(jìn)行固定，H& E 染色，用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片進(jìn)行明場拍照。同時(shí)切 10 片厚度為 10 μm 的冰凍切片，提取 RNA，通過計(jì)算 RIN 值來評估其質(zhì)量。為了獲得先進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議用 RIN 值大于 7 的組織塊做 Visium 的實(shí)驗(yàn)。
首先對 OCT 包埋的組織進(jìn)行冰凍切片，將切好的組織放置于組織優(yōu)化玻片上的捕獲區(qū)域。接下來對組織切片進(jìn)行固定，H&E 染色，用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片拍照，拍照完成后會繼續(xù)對組織切片進(jìn)行通透處理，使細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 釋放出來，被玻片上的 oligo 所捕獲，在合成一鏈 cDNA 的時(shí)候，摻入帶有熒光基團(tuán)的堿基，這樣合成好的 cDNA 就帶有熒光，接下來會通過酶消化去除玻片上殘留的組織，暴露帶有熒光的 cDNA，用 Cy3 通道的熒光顯微鏡，掃描整張片子，獲得熒光染色的圖片，組織優(yōu)化的所有實(shí)驗(yàn)都在玻片上完成。
先對 OCT 包埋的組織進(jìn)行冷凍切片，將切好的組織切片放置于基因表達(dá)玻片上的捕獲區(qū)域。接下來對組織切片進(jìn)行固定，H&E 染色，用帶掃描功能的顯微鏡對組織切片進(jìn)行拍照，獲得組織形態(tài)信息。拍照完成后會繼續(xù)對組織切片進(jìn)行通透處理，使細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 釋放出來，被玻片上的 oligo 所捕獲，在玻片上進(jìn)行一鏈和二鏈 cDNA 的合成，合成二鏈 cDNA 后會做變性處理，將合成好的二鏈 cDNA 回收到 ep 管中，后面的所有實(shí)驗(yàn)都在 ep 管中完成，包括 cDNA 的擴(kuò)增和文庫的構(gòu)建。空間基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)可以大致分為兩部分，首要部分從組織固定到二鏈 cDNA 的合成，都是在基因表達(dá)玻片上完成。第二部分從 cDNA 的擴(kuò)增到文庫的構(gòu)建，都是在 ep 管中完成。
之所以用異戊烷凍存組織，而不是將組織直接放置于液氮中，是因?yàn)橐旱姆悬c(diǎn)比較低，如果將組織直接放到液氮里，液氮會沸騰，在組織周圍形成氣穴，導(dǎo)致組織不同區(qū)域的降溫速度不同，容易在速凍過程中改變組織內(nèi)部的形態(tài)，甚至使組織發(fā)生碎裂。而異戊烷的沸點(diǎn)比較高，將組織放置于異戊烷中，異戊烷不會沸騰，這樣組織不同區(qū)域降溫速度相同，就避免了在速凍過程中發(fā)生變形或者是碎裂。
目前只有包埋在 OCT 中的新鮮冷凍組織經(jīng)過了 Visium 空間基因表達(dá)解決方案的驗(yàn)證。10X Genomics 的研發(fā)團(tuán)隊(duì)成員正在積極研究 FFPE 組織相關(guān)的應(yīng)用，并且已經(jīng)獲得一些初步結(jié)果，預(yù)計(jì)在 2021 年會推出適用于 FFPE 組織的實(shí)驗(yàn)方案。
目前，Visium 空間基因表達(dá)流程是針對 H &E 染色而優(yōu)化的。將 IHC 染色整合到此流程中是 10X Genomics 研發(fā)團(tuán)隊(duì)積極研究的另一個(gè)領(lǐng)域，預(yù)計(jì)在 2020 年上半年推出。
不會，10X Genomics 官方實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H&E 染色不僅不會對樣本 RNA 質(zhì)量產(chǎn)生影響，染色后還會提高基因檢測數(shù)。
運(yùn)輸組織樣本：先用異戊烷凍存，將凍存好的組織放在密封的容器中，再將裝有冷凍組織的容器用密封袋封好，放置于干冰中運(yùn)輸，樣本到達(dá)目的地后迅速轉(zhuǎn)移到 -80℃冰箱保存。
運(yùn)輸已經(jīng)貼了組織切片的玻片：可以將玻片放置于密封的容器中，并將玻片固定好，再將裝有玻片的容器用密封的袋子封好，放置于干冰中運(yùn)輸。同樣樣本到達(dá)目的地后，迅速轉(zhuǎn)移到 -80℃冰箱進(jìn)行保存。這里還要注意，一旦玻片上貼好了組織切片，只能保存 7 天。
在 10X 測試過的組織類型中，有三種組織還需要進(jìn)一步的優(yōu)化，包括樣本制備的優(yōu)化和組織通透性的優(yōu)化，分別是皮膚，胰腺和骨組織。
10X Genomics 測試過很多組織類型，大多數(shù)都可以用于空間轉(zhuǎn)錄組的分析。下圖是他們官網(wǎng)上測試過的組織類型的列表，測試過的組織都可以運(yùn)用在空間轉(zhuǎn)錄組的分析上面。但建議用戶用基因表達(dá)玻片做正式實(shí)驗(yàn)前，務(wù)必用組織優(yōu)化的玻片測試一下，看組織能否用于空間轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也找到好的組織通透時(shí)間。
切片厚度基本上以 10μm 為主，但也有少量組織例外。
可以，Visium 空間基因表達(dá)玻片上可以檢測不同類型的組織。每張玻片包含 4 個(gè)捕獲區(qū)域，因此一張玻片上至多可檢測四種不同類型組織的切片。每種組織好的透化時(shí)間需要通過組織優(yōu)化（TO）實(shí)驗(yàn)來預(yù)先確定，每種類型的組織使用一張 TO 玻片。
是的，根據(jù)組織中待研究的具體區(qū)域，帶條形碼的捕獲點(diǎn)可能覆蓋不止一種類型的細(xì)胞。具體取決于組織類型、組織內(nèi)的細(xì)胞大小以及這些細(xì)胞的密度。研究人員可看到每個(gè)點(diǎn)大約捕獲 1 到 10 個(gè)細(xì)胞。您可以將每個(gè)捕獲點(diǎn)想象為一種“微型批量”的實(shí)驗(yàn)，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，研究人員收集一小批細(xì)胞的平均基因表達(dá)數(shù)據(jù)。這是 10x Genomics 的研究團(tuán)隊(duì)正在積極研究的另一領(lǐng)域，目的是盡量讓捕獲點(diǎn)變得更小。
無論您在處理過程中是否使用了所有捕獲區(qū)域，玻片僅供一次性使用。這是因?yàn)榱鞒讨邪硕鄠€(gè)步驟，包括對玻片進(jìn)行染色、沖洗和重新干燥，這些步驟會破壞未使用的捕獲區(qū)域上的寡核苷酸條形碼，并降低其整體的靈敏度。
Visium 配件試劑盒中的成像測試玻片有兩個(gè)用途。一，確定客戶的成像系統(tǒng)是否與 Visium 兼容。二，用于成像程序的設(shè)置，以便在 Visium 組織優(yōu)化和基因表達(dá)流程中獲取圖像。
在捕獲區(qū)域四周有一圈由灰色小點(diǎn)組成的基準(zhǔn)邊界，提供組織切片的空間定位信息。
Visium 空間轉(zhuǎn)錄組的文庫，可以在 Illumina 所有測序儀上測序，文庫的結(jié)構(gòu)如下圖所示，需要雙端 index 測序。
建議的測序方式是為 Read 1：28 個(gè) bp，i7 index：10 個(gè) bp，i5 index：10 個(gè) bp，Read 2：120bp。Read 1 用于測試 Spatial Barcode 和 UMI，Read 2 用于測試插入片段。不建議將 visium 的文庫與其他單 index 的 10x 文庫混合測序。
與單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不同，我們無法根據(jù)細(xì)胞數(shù)計(jì)算空間轉(zhuǎn)錄組文庫的測序量，因?yàn)槲覀儾恢澜M織切片當(dāng)中有多少細(xì)胞，我們根據(jù)組織切片占捕獲區(qū)域的比例計(jì)算測序量，計(jì)算測序量的時(shí)候，只考慮被組織切片覆蓋的 spot，每個(gè) spot 的推薦底限起始測序量是 5 萬個(gè) read pairs，根據(jù) H &E 染色的結(jié)果可以估算捕獲區(qū)域到底有多少百分比的 spot 被組織覆蓋。
計(jì)算測序量很簡單，比如我們假設(shè)一個(gè)組織覆蓋了捕獲區(qū) 50% 的面積，我們就用 0.5×5000×5 萬個(gè) read pairs per spot，得出測序量是 125 個(gè) million read pairs。這里面 0.5 就代表著覆蓋了捕獲區(qū)域 50% 的面積，5000 就代表著每一個(gè)捕獲區(qū)域總共有 5000 個(gè) spot，再乘以 5 萬，5 萬就是每個(gè) spot 我們推薦的底限測序的量，就是 5 萬個(gè) read pairs per spot。測序量與組織大小、組織類型和基因表達(dá)水平相關(guān)。
通常，研究人員需要具備一點(diǎn)點(diǎn)生物信息學(xué)經(jīng)驗(yàn)來使用 Space Range。Space Range 流程在 Linux 服務(wù)器上運(yùn)行；這就需要研究人員了解基本的命令行操作，以及如何登錄和退出 Linux 服務(wù)器。不過，在大多數(shù)情況下，Space Range 是高度自動化的。讓軟件正常運(yùn)作的文件和算法都已經(jīng)包含在內(nèi)。因此，研究人員只需在測序后將兩個(gè)輸入文件提供給 Space Range，讓軟件生成空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)。
Loupe Browser 有著完全圖形化的界面，并且根本不需要編程。不過，您在研究過程中可能會碰到某個(gè)時(shí)刻，比如想了解空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)的一個(gè)具體問題，或者創(chuàng)建一個(gè)自定義圖形。那么，這就需要您學(xué)習(xí) R 語言或其他腳本編程語言。
抱歉，不可以。因?yàn)閿?shù)據(jù)類型不同，它們無法兼容。如果您有這種類型的數(shù)據(jù)，仍然建議您使用現(xiàn)有的處理空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的分析流程。
沒錯(cuò)！事實(shí)上，分析空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)的第三方工具的數(shù)量正在迅速增長。目前的一些選擇包括 Spaniel 和 Giotto。Seurat 也是一種選擇。Space Range 流程的輸出矩陣與 Cell Ranger 的 Feature Barcode 輸出矩陣的格式相同。研究人員可將此輸出文件直接輸入 Seurat 中進(jìn)行進(jìn)一步的分析。您可以通過 https://satijalab.org/seurat/v3.1/spatial_vignette.html 了解 Seurat 流程處理空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)的更多信息。
此外，10x Genomics 的計(jì)算生物學(xué)家還創(chuàng)建了 R 資源，可以幫助客戶對其樣本開展深度分析。這些 R 資源讓研究人員能夠一次觀察多個(gè)基因、樣本或特征，如基因、UMI 和聚類。如果研究人員想分析不同特征的樣本，或不同實(shí)驗(yàn)條件下的樣本（如野生型、患病和治療中的樣本），這可能特別有用。您可以在我支持網(wǎng)站上訪問這些 R 資源（https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/rkit)。
